ارائه کننده: شهره رحیمی

استاد راهنما: رضا حسن ساجدی

داور داخلی: فرنگیس عطایی،‌ صادق حسن‌نیا

داور خارجی: علی‌اصغر کارخانه‌ای،‌ آزاده ابراهیم حبیبی

نماینده تحصیلات تکمیلی: فرنگیس عطایی

تاریخ: ۱۴۰۵/۰۶/۳۱

ساعت : ۱۰

مکان : اتاق  دفاع- 5009

چکیده:

دی-پارا-هیدروکسی‌فنیل‌گلایسین (D-HPG) یکی از ترکیبات حد واسط مهم در تولید آنتی‌بیوتیک‌های نیمه‌سنتزی β-لاکتام است. اگرچه این ترکیب به روش شیمیایی قابل سنتز می‌باشد، فرآیندهای شیمیایی متداول با هزینه‌های بالای تولید و آلودگی‌های زیست‌محیطی همراه هستند. ازاین‌رو، توسعه روش‌های زیستی به‌عنوان جایگزینی مناسب مورد توجه قرار گرفته است. در میان روش‌های بیوکاتالیستی، آبشار آنزیمی متشکل از D-هیدانتوئیناز (D-Hase) و D-کاربامویلاز (D-Case) روشی موثر برای تبدیل گزینش‌پذیر DL-پارا-هیدروکسی‌فنیل‌هیدانتوئین (DL-HPH) به D-HPG با خلوص نوری بالا محسوب می‌شود. این مسیر آنزیمی پیش‌تر در میزبان‌های میکروبی برای تبدیل زیستی  سوبستراهای راسمیک به صورت تمام سلولی به کار گرفته شده ‌است. با وجود مزایا، استفاده از آنزیم‌های درون‌سلولی در سامانه‌های تمام‌سلولی می‌تواند با محدودیت‌هایی از جمله انتقال ناکارآمد سوبسترا و محصول از غشای سلولی و کاهش دسترسی سوبسترا به جایگاه فعال آنزیم همراه باشد. در این پژوهش، به‌منظور رفع این محدودیت‌ها، یک سامانه نمایش سطحی باکتریایی طراحی شد که در آن آنزیم‌های D-Hase و D-Case با استفاده از ناحیه N-ترمینال پروتئین هسته‌زای یخ(InaK-N; INP)  به عنوان موتیف لنگر، بر روی غشای خارجی E. coli بیان شدند. این طراحی دسترسی مستقیم سوبسترا به جایگاه‌های کاتالیزوری را فراهم کرده و محدودیت‌های انتشار درون‌سلولی را به حداقل می‌رساند. قرارگیری صحیح هر دو آنزیم در سطح سلول با استفاده از هضم پروتئازی توسط TEV protease و Proteinase K تأیید گردید. فعالیت کاتالیزوری آنزیم‌های نمایش‌داده‌شده در سطح با روش‌های رنگ‌سنجی و کروماتوگرافی تعیین شد. فعالیت ویژه آنزیم‌های نمایش‌یافته بر سطح سلول برای D-Hase بر اساس سرعت اولیه مصرف سوبسترا 7/۲ میکرومول بر دقیقه بر میلی‌گرم وزن خشک سلولی و برای D-Case معادل10 میکرومول بر دقیقه بر میلی‌گرم وزن خشک سلولی تعیین شد. هر دو آنزیم پایداری حرارتی بالایی با T₅₀  در محدوده ۷۰-۷۵ درجه سانتی‌گراد نشان دادند. همچنین، این دو آنزیم قابلیت استفاده مجدد مناسبی از خود نشان دادند، به طوری‌که فعالیت  D-Hase  و D-Case پس از پنج چرخه متوالی به ترتیب بیش از ۹۶٪ و ۹۴٪   فعالیت اولیه حفظ شد. در آزمایش‌های تبدیل زیستی، سلول‌های مهندسی‌شده پس از ۶ ساعت توانستد DL-HPH  را با بازده تبدیل مولی ۹4٪ به D-HPG تبدیل کنند. در مجموع سامانه نمایش سطحی مبتنی بر INP می‌تواند یک بستر کارآمد و مقرون‌به‌صرفه برای تولید باشد.