ارائه کننده:  کاترین ابراهیمی

استاد راهنما: دکتر فرنگیس عطایی

استاد مشاور: دکتر سامان حسینخانی

داور داخلی: دکتر صادق حسن نیا، دکتر رضا حسن ساجدی

داور خارجی: دکتر داریوش مینایی، دکتر میترا نوربخش

نماینده تحصیلات تکمیلی: دکتر رضا حسن ساجدی

تاریخ : ۱۴۰۵/۰۳/۲۰ 

ساعت: ۱۳ تا ۱۵ 

مکان: سالن دفاع  دانشکده علوم پایه

چکیده:

پروتئین‌های بازدارنده آپاپتوز (IAP) از طریق مهار کاسپازها موجب بقا و مقاومت سلول‌های سرطانی به ‌درمان می‌شوند. از میان آنها، XIAP بصورت مستقیم به کاسپاز-3 و کاسپاز-9 متصل می شود و عملکرد ضدآپوپتوتیک خود را اعمال می‌کند و با افزایش بیان آن در سیر پیشرفت بیماری، منجر به سرکوب آپاپتوز، پیشرفت تومور و مقاومت به دارو می شود. لذا سنجش برهمکنش XIAPبا کاسپازها و شناسایی آنتاگونیست‌های آن به‌عنوان رویکردی هدفمند برای ترمیم فرآیند آپاپتوز در سلول‌های سرطانی و تنظیم تعادل میان بقا و مرگ سلولی حائز اهمیت است. هدف از این پژوهش ، طراحی و ساخت یک گزارشگر نوترکیب با استفاده از تکنیک لوسیفراز دوبخشی مبتنی بر دومین‌های BIR2-BIR3 از پروتئین XIAP و مقایسه آن با دمین BIR2 در میانکنش با کاسپاز-3 بود، همچنین پایش تعامل آن با هر دو نوع کاسپاز-3 و 9 مورد بررسی قرار گرفت. ژن هدف در وکتورpET28a بصورت BIR2-BIR3-Nluc کلون و در باکتری E. coli BL21 بیان و سپس تخلیص شد. همچنین سازه های BIR2-Nluc ، Caspase3-CLuc و Caspase9-Cluc بیان و تخلیص شدند. پس از بررسی برهمکنش جفت پروتئین ها، نتایج نشان داد که پروتئین حاوی دو دومین BIR2-BIR3-Nluc در میانکنش با Caspase3-Cluc منجر به بازیابی بالاتر فعالیت لوسیفرازی در مقایسه با سازه تک ‌دومین BIR2-Nluc شد. نتایج برهمکنش سازه BIR2-BIR3-Nluc با هر دو نوع کاسپاز نشان داد که تعامل با Caspase9-Cluc موجب افزایش قابل توجه بازیابی سیگنال لومینسانس نسبت به برهمکنش با Caspase3-Cluc شد. سپس اثر داروهای کربوپلاتین، سیس پلاتین و اگزالی پلاتین و ترکیب پودوفیلوتوکسین بر میانکنش آنها ارزیابی شد که داروهای خانواده پلاتین در غلظت های نسبتا بالا بر میانکنش این پروتئین ها اثر گذار بودند. همچنین، تیمار BIR2-BIR3-Nlucبا پودوفیلوتوکسین منجر به کاهش قابل توجه سیگنال لومینسانس در برهمکنش با Caspase9-Cluc شد. مطالعات داکینگ مولکولی، شامل محاسبه انرژی اتصال و شناسایی اسیدهای آمینه درگیر در برهمکنش ها، یافته‌های تجربی را تأیید کرد. در مجموع، گزارشگر طراحی‌شده می‌تواند به‌عنوان ابزاری کارآمد برای ارزیابی و غربالگری مهارکننده‌ها و فعال‌کننده‌های موثر بر میانکنش XIAP و دو نوع کاسپاز3 و 9 در محیط خارج سلولی مورد استفاده قرار گیرد.کلمات کلیدی: آپاپتوز، کاسپاز-3، کاسپاز-9،BIR2-BIR3 XIAP-، لوسیفراز دوبخشی، پودوفیلوتوکسین