ارائه کننده: محمد شمسی رهنی

استاد راهنما: دکتر سامان حسینخانی

استاد مشاور: دکتر سید عباس شجاع الساداتی

استاد مشاور دوم: دکتر فرنکیس عطایی

داور داخلی: دکتر صادق حسن نیا، دکتر رضا حسن ساجدی

داور خارجی: دکتر آزاده ابراهیم حبیبی، دکتر محبوبه نظری

نماینده تحصیلات تکمیلی: دکتر صادق حسن نیا

تاریخ: ۱۴۰۵/۰۴/۰۷ 

ساعت: 8:30

مکان : اتاق 5009

چکیده:

آنزیم انتروکیناز یک سرین‌پروتئاز اختصاصی و حیاتی است که به دلیل توانایی در شناسایی دقیق توالی (DDDDK) و برش پروتئین‌های الحاقی، کاربرد گسترده‌ای در زیست‌فناوری و تحقیقات پزشکی دارد. با این وجود، روش‌های رایج برای سنجش فعالیت این آنزیم نظیر روش‌های فلوریمتریک نیازمند سوبستراهای تجاری گران‌قیمت بوده و روش‌های بر پایه ژل نیز فاقد حساسیت و قابلیت کمّی‌سازی مناسب هستند. از این رو، پژوهش حاضر با هدف طراحی، تولید و ارزیابی یک زیست‌حسگر بیولومینسانس نوین و مقرون‌به‌صرفه بر پایه تکنیک جابجایی حلقوی (Circular Permutation) در آنزیم لوسیفراز کرم شب‌تاب انجام شد.

در این مطالعه، ابتدا ژن زنجیره سبک انتروکیناز در وکتور بیانی pGAPZαA کلون گردید و به منظور انجام صحیح اصلاحات پس از ترجمه، در مخمر Pichia pastoris (سویه X-33) به صورت ترشحی بیان شد. در بخش دیگر، زیست‌حسگر اختصاصی (CP-EK) با استفاده از تکنیک SOE-PCR طراحی گردید؛ به گونه‌ای که انتهاهای طبیعی لوسیفراز به یکدیگر متصل شده و توالی شناسایی انتروکیناز در محل برش جدید (اسید آمینه ۲۳۳) تعبیه شد. این سازه در باکتری E. coli BL21(DE3) بیان و به روش کروماتوگرافی تمایلی خالص‌سازی گردید. به منظور بهینه‌سازی شرایط سنجش، از ساکارز (۱ مولار) به عنوان اسمولیت جهت حفظ پایداری ساختاری لوسیفراز در انکوباسیون ۲۰ ساعته در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد استفاده شد. همچنین ارزیابی‌های ساختاری و میان‌کنش‌های مولکولی با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی (AlphaFold2 و HADDOCK) انجام گرفت.

نتایج نشان داد که انتروکیناز نوترکیب با بازدهی مطلوب در مخمر تولید شده و دارای فعالیت کاتالیتیک بیولوژیک است. زیست‌حسگر CP-EK نیز با موفقیت بیان شد و نتایج سنجش بیولومینسانس حاکی از اختصاصیت بالای آن نسبت به انتروکیناز بود؛ در حالی که هیچ‌گونه سیگنالی در مواجهه با جایگاه‌های غیرهدف (نظیر جایگاه کاسپاز-۳) مشاهده نشد. علاوه بر این، ارزیابی این سیستم در حضور متفورمین، توانایی بالای زیست‌حسگر را در غربالگری مهارکننده‌های آنزیمی به اثبات رساند. مطالعات بیوانفورماتیکی نیز ضمن تأیید حفظ یکپارچگی ساختاری لوسیفرازِ مهندسی‌شده، نشان داد که تشکیل شبکه پیوندهای هیدروژنی و پل‌های نمکی عامل اصلی شناسایی و اتصال دقیق سوبسترا به جایگاه فعال انتروکیناز است. در نتیجه، زیست‌حسگر طراحی‌شده ابزاری بسیار حساس، اختصاصی و از نظر اقتصادی مقرون‌به‌صرفه است که می‌تواند به عنوان جایگزینی قدرتمند برای روش‌های رایج در سنجش فعالیت انتروکیناز و مطالعات کشف دارو مورد استفاده قرار گیرد.