ارائه کننده: مینا حنیفه آهق

استاد راهنما: دکتر فرنگیس عطایی

استاد مشاور: دکتر سامان حسینخانی

داور داخلی: دکتر رضا حسن ساجدی، دکتر صادق حسن نیا

داور خارجی: دکتر ابوالفضل گلستانی، دکتر مجید مهدوی

نماینده تحصیلات تکمیلی: دکتر رضا حسن ساجدی

تاریخ: ۱۴۰۵/۰۴/۳۰ 

ساعت: ۱۵ تا ۱۷

مکان : اتاق دفاع 5009

چکیده:

S26 پروتئازوم از مهم‌ترین سیستم های پروتئولیتیکی سلول است که نقش اساسی در حفظ هموستاز سلولی با حذف پروتئین‌های آسیب‌دیده یا نابجا دارد. با توجه به ارتباط مستقیم اختلال عملکرد پروتئازوم با بیماری‌هایی نظیر سرطان و بیماری‌های نورودژنراتیو، توسعه روش ‌های حساس برای پایش فعالیت آن از اهمیت ویژه‌ای در تشخیص بیماری و ارزیابی اثر بخشی درمان برخوردار است. در این راستا پروتئین‌های بیولومینسانس به دلیل حساسیت بالا و قابلیت آشکارسازی دقیق آنالیت‌های زیستی به ابزارهای ارزشمندی در طراحی سامانه‌های گزارشگر زیستی تبدیل شده است. با توجه به اهمیت اندازه‌گیری اختصاصی فعالیت زیرواحدهای آنزیمی پروتئازوم، در این پژوهش سه مدل گزارشگر بیولومینسانس مبتنی بر لوسیفراز حلقوی جابه‌جا شده (Circularly Permuted Luciferase; CPL) شامل CPL-Chy، CPL-Cas  و CPL-Try به‌ترتیب برای پایش فعالیت‌های شبه‌-کیموتریپسینی، شبه-‌کاسپازی و شبه-‌تریپسینی پروتئازوم طراحی، تولید و ارزیابی شدند. در این سازه‌ها، جایگاه‌های اختصاصی برش هر یک از این زیرواحدها در ساختار لوسیفراز تعبیه و ژن لوسیفرازهای تغییریافته کلون شدند. سپس پروتئین‌های نوترکیب در باکتری بیان شدند و پس از خالص سازی، فعالیت آن‌ها در حضور لیزات سلولی رده‌های HEK293T، MCF-7 و HL-60  بررسی شد. نتایج نشان داد که هر سه نوع گزارشگر در حضور لیزات حاوی پروتئازوم سلولی، افزایش معنی‌داری در سیگنال بیولومینسانس نشان می‌دهند و شرایط بهینه سنجش در دمای 4 درجه سانتی‌گراد و زمان 5 دقیقه تعیین شد. بررسی اختصاصیت آنها نشان داد که پروتئازهای غیرپروتئازومی از جمله کاسپاز-3 و انتروکیناز قادر به فعال‌سازی گزارشگرهای CPL نیستند. همچنین تیمار نمونه‌ها با بورتزومیب به عنوان مهارکننده پروتئازوم،  موجب کاهش وابسته به دوز سیگنال لومینسانس در هر سه نوع گزارشگر شد که وابستگی پاسخ‌ها به فعالیت پروتئازوم را تأیید کرد. ارزیابی عملکرد کمی گزارشگرها شامل تعیین محدوده خطی پاسخ، حد تشخیص (LOD)، حد کمّی‌سازی (LOQ)، Fold Change  و IC50 نشان داد که گزارشگر CPL-Chy  در مقایسه با دو سازه دیگر از حساسیت بالاتر و دامنه پاسخ گسترده‌تر در آشکارسازی تغییرات فعالیت پروتئازومی برخوردار است. علاوه بر این، مدل‌سازی ساختاری با استفاده از AlphaFold 2 حفظ ساختار کلی لوسیفراز و دسترس‌پذیری مناسب جایگاه‌های برش طراحی‌شده را تأیید نمود. در مجموع، نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که این گزارشگرهای توسعه‌یافته، ابزارهای مناسبی برای پایش اختصاصی فعالیت زیرواحدهای پروتئازوم، ارزیابی اثر ترکیبات مهارکننده در مطالعات سلولی و غربالگری ترکیبات بالقوه دارویی هستند.